分离路线取决于目标成分在胞内还是胞外。胞外产物走「固液分离、澄清、浓缩」路线，胞内产物则要先破碎菌体再提取，两条路线最后都会接灭菌与精滤工序。
典型流程是：发酵结束后先灭活与灭菌，终止菌体代谢并满足微生物指标要求；随后通过离心或板框过滤去除菌体与不溶物，得到澄清滤液；若目标为胞内成分，则在此步改用高压均质、超声或酶解等方式破碎细胞，再分离细胞碎片；滤液接着经膜过滤或真空浓缩调整浓度并脱盐，必要时用活性炭或大孔树脂做脱色与选择性富集；最后以除菌过滤收尾，得到符合微生物指标的成品。
选择分离工艺时的核心权衡是回收率与活性保留之间的平衡：步骤越多、受热时间越长，回收率往往越高而热敏性成分损失越大。因此工程上会先确定标志物，按标志物回收率反推最优工序组合。具体设备型式与操作条件视产物性质与规模而定。